2021年10月15日 更新

リアルタイムPCRにおける1 Step RT-PCR法と2 Step RT-PCR法の比較 -最適なプロトコールを選ぶためのヒント-

リアルタイムPCRを用いてRNAサンプルを解析する際、反応系を1 Stepにすべきか、2 Stepにすべきか悩んだ経験はないでしょうか?
リアルタイムPCR(qPCR)は、遺伝子の発現量を正確に解析するためによく用いられる強力な手法です。RNAサンプルからスタートする場合は、最初に逆転写反応(RT)を行ってcDNAを調製する必要があります。1 Step RT-qPCR法ではRTとqPCRを同じチューブ内で行い、2 Step RT-qPCR法ではRTとqPCRを別々のチューブ内で行います。どちらの方法にも利点と欠点があるため、どちらのプロトコールがワークフローに適しているかを検討することが重要です。本記事では、1 Step RT-qPCR法と2 Step RT-qPCR法についてご紹介いたします。

1 Step RT-qPCR法のワークフロー

1 Step RT-qPCR法のワークフロー

1 Step RT-qPCR法のワークフロー

利点
・シンプルで速い
・解析対象の遺伝子数が少ない場合に最適
・ハイスループット解析に応用しやすい

一般に、1 Step RT-qPCR法は高速のハイスループット解析に最適です。1本のチューブで反応が完結する本プロトコールは、セットアップが容易で、自動分注装置、またはその他のハイスループットシステムを用いて多数のサンプルを処理することができます。また、操作時間が少なく、ピペッティングエラーやコンタミネーションのリスクを抑えることができます。1 Step RT-qPCR法は、解析対象の遺伝子数が少なく、サンプル数が多いワークフローに最適です。

欠点
・RTステップを最適化できない
・cDNAのストックを調製できない

1 Step RT-qPCR法では、RTとqPCRのステップが同じチューブ内で行われるため、反応組成を別々に最適化することができません。よって、いずれかのステップで収量、または効率が低くなる可能性があります。さらに、合成されたcDNAが次のqPCRステップで全て使われてしまいます。よって、更なるバリデーションや他の実験用にcDNAのストックを調製することができません。

2 Step RT-qPCR法のワークフロー

2 Step RT-qPCR法のワークフロー

2 Step RT-qPCR法のワークフロー

利点
・限られた量のRNAサンプルから効率的な解析が可能
・RTとqPCRのステップを別々に最適化できる
・cDNAのストックを調製できる

2 Step RT-qPCR法は、少量RNAサンプルからの効率的な解析が要求される実験に最適です。RTとqPCRのステップを別々に最適化することができるため、反応の特異性及び効率性を最大限確保することができます。サンプル数が少なく、解析対象の遺伝子数が多いワークフローに最適です。2 Step RT-qPCR法のもう1つの利点は、qPCR反応を行うチューブとは別のチューブでcDNAを調製する点です。これにより、cDNAをストックとして保存し、他の遺伝子解析やバリデーションに使用することができます。

欠点
・操作が煩雑、時間がかかる
・ハイスループット解析への応用が難しい

一般に、2 Step RT-qPCR法のプロトコールは、時間がかかり、より多くのピペッティング工程が必要です。よって、ばらつきが大きくなり、コンタミネーションのリスクも上昇します。また、RTとqPCRのステップを別々に最適化して感度や効率性を向上させることができる点は、1つではなく2つの反応を最適化しなければならないという欠点にもなります。最後に、2本のチューブを使用する本プロトコールは、自動化ハイスループットのワークフローに応用させることが難しいため、操作時間が長くなります。

まとめ

リアルタイムPCRの最適化及び結果の一貫性を確保するには、適切なプロトコールの選択が重要です。一般に、1 Step RT-qPCR法は、解析対象の遺伝子が少なく、多数のサンプルを高速かつハイスループットで増幅する必要がある場合に最適です。2 Step RT-qPCR法は、少量のRNAサンプルから多数のターゲット遺伝子を効率よく解析できるという点で優れています。ワークフローやニーズに合わせて、どちらかの逆転写プロトコールをお選びください。弊社の選択ガイドをご利用になり、用途に適したキットをお探しください。

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