【初心者向け】TAクローニングをわかりやすく解説

TAクローニングとは？

TAクローニング（TA Cloning）は、分子生物学における遺伝子操作技術の一つで、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅されたDNA断片を簡便にクローニングする方法です。この技術は、PCR産物の末端にデオキシアデノシン（dA）が一塩基付加されることを利用して、3’末端にデオキシチミジン（dT）を一塩基付加したTベクターに挿入することで行われます。この方法により、目的DNA断片を迅速かつ効率的にクローニングすることが可能です。

TAクローニングの基本的な流れ

インサートDNAの調製： Taq DNAポリメラーゼなどPCR産物の3’末端にdAを付加するPCR酵素を用いて目的のDNA断片を増幅します。PrimeSTARシリーズなどPCR産物が平滑末端となるPCR酵素を用いる場合は、増幅産物の3’末端にdAを付加する必要があります。

ベクターの準備：3’末端にdTを一塩基付加したTベクター（T-Vector pMD20、T-Vetor pMD19 (Simple)など）を用意します。

ライゲーション反応：インサートDNA（PCR産物）とTベクターを混合し、ライゲーション反応を行います。インサートDNAのdA オーバーハングとベクターの dTオーバーハングを相補的に結合します。

形質転換：ライゲーション反応後の溶液を大腸菌コンピテントセルに導入し、形質転換を行います。

コロニー選択：LB選択プレート（抗生物質、X-Gal、IPTGを含む）で、コロニーの青／白判定を行います。白いコロニーが候補になります。

コロニーPCR：プレート上の白いコロニーを少量掻きとり、コロニーPCRを行います。PCR反応液の一部を用いてアガロース電気泳動を行い、インサートの有無を確認します。

TAクローニングは、初心者にとって取り組みやすい技術であり、迅速かつ効率的に遺伝子クローニングを行うことができます。

注意点：PCR酵素の種類と末端形状

PCR酵素の種類と末端形状：PCR酵素は大きく2つのタイプに分けられます。Taq DNA PolymeraseをはじめとするPol I型（family A）酵素と、Pfu DNA Polymeraseに代表されるα型（family B）酵素です。
Pol I型（family A）酵素のPCR産物は、3ʼ末端にデオキシアデノシン（dA）が一塩基付加されているので、PCR産物をそのままTAクローニングに利用可能です。
α型（family B）酵素のPCR産物は平滑末端になっており、そのままではTAクローニングに使用できません。平滑末端のPCR産物を TAクローニングに用いる場合は、3’末端にdAを付加する必要があるので、dAを付加する試薬が含まれたMighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTARをご利用ください。

必要な材料と機器

PCR酵素：TaKaRa Ex Taq Hot Start Versionなど

Tベクター：TaKaRa T-Vector pMD20、T-Vetor pMD19 (Simple)。
形質転換体の青／白選択が可能なTベクターです。

Mighty TA-cloning Kit：Tベクターとライゲーション試薬が含まれます。

Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR：Tベクター、ライゲーション試薬と平滑末端のPCR産物の3’末端にdAを付加する試薬が含まれます。

コンピテントセル：E. coli HST08 Premium Competent Cells、E. coli JM109 Competent Cells、E. coli DH5α Competent Cellsなど、青／白選択が可能なクローニング用のコンピテントセルを使用します。

LBプレート：抗生物質（アンピシリン）、X-Gal、IPTG^＊を添加したLBプレートを用意します。
＊E. coli HST08 Premium Competent Cells、E. coli DH5α Competent Cellsの場合は不要

PCR装置：インサートDNAの増幅や、コロニーPCRに使用します。
Clontech PCR Thermal Cycler GP等

アガロース電気泳動装置、電気泳動用試薬：PCR産物の確認に使用します。
Mupid-2plus等
アガロース、DNAマーカー　等

インキュベーター：形質転換されたコンピテントセルの培養を行います。

コロニーPCR：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix、プライマー　等

よくあるトラブルとその対処法

TAクローニングで目的のクローンが得られない場合、いくつかの原因が考えられます。以下によくあるトラブルとその対処法（トラブルシューティング）をまとめました。

原因：PCR産物にdAのオーバーハングがない。
対処法：TaKaRa Ex Taqなど、dAが付加されるPCR酵素を使用する。
PrimeSTARシリーズなど、平滑末端になるPCR酵素を使用した場合は、dAを付加する操作を行う。

原因：ライゲーション反応がうまくいっていない。
対処法：Tベクターとインサートのモル比を見直す。
インサートDNA（PCR産物）の純度が低い場合、再精製を行う。

原因：形質転換がうまくいっていない。
対処法：プレートの抗生物質（アンピシリンなど）の濃度が適切かを確認する。
コンピテントセルの効率を確認する。高効率のコンピテントセルを使用する。（＞10⁸ cfu/μg）

原因：インサートのサイズが大きい。（5 kb以上）
対処法：長鎖のPCR産物（5 kb以上）の場合、TAクローニング効率が低下するため、平滑末端クローニングをお勧めします。その場合、末端平滑化およびリン酸化のための簡便な前処理用試薬を含むMighty Cloning Reagent Set (Blunt End)の使用が便利です。

クローニングの最新技術

TAクローニングは、分子生物学の分野で広く利用されている技術ですが、さらに効率的で便利な最新のクローニング技術として「In-Fusionクローニング」が注目されています。この技術は、使用する任意のベクターの末端配列を利用してクローニングを行うため、あらゆるベクターが使用でき、余分な配列が一切付加されずにクローニングを行うことができる優れた手法です。
In-Fusionクローニングは、TA クローニングではできない複数DNA断片を一度に挿入するマルチクローニングやディレクショナルクローニングも可能です。この技術を取り入れることで、より効率的に遺伝子クローニングを行うことが可能です。