ロングリードシーケンスをご存じですか？
ロングリードシーケンスは、リピート領域や構造変異を高精度に解析できることから、がんゲノムや希少疾患研究をはじめとするさまざまな分野で利用が拡大しています。
近年では、特定領域を効率的に増幅できる多領域PCR（マルチプレックスPCR）と組み合わせることで、解析コストを抑えながら目的領域を解析できるターゲットロングリードシーケンスへの注目が高まっています。
一方で、PCRを利用したロングリードシーケンスには、いくつかの技術的課題が存在します。
そこで、タカラバイオでは、PCRを利用したロングリードシーケンス向けに最適化したPCR酵素「PrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase」 を開発しました。
PCRを用いたロングリードシーケンスの課題
・アンプリコン長の制限
一般的なPCR酵素では長鎖DNAの安定した増幅が困難
・配列依存の増幅バイアス
GC/ATリッチ領域などの難配列では増幅効率が低下
・PCRエラーの蓄積
長鎖になるほどサイクルごとの増幅エラーが蓄積
・マルチプレックスPCR時の特異性低下
プライマー数が増えることで非特異的増幅のリスクが上昇
PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseの特長
PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseは以下の特長があります。
- 50 kbを超える超長鎖増幅が可能
- GC/ATリッチなどの難配列も長鎖増幅可能
- 高い特異性による非特異的増幅の抑制
- 長鎖マルチプレックスPCRへの適応
- 正確性が高く、ロングリードシーケンスでの鋳型増幅に最適
詳細は製品情報ページをご覧ください。
PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを用いたアプリケーションのご紹介
では実際に、PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseがロングリードシーケンス向けのPCRでどのような性能を発揮するのか、代表的なアプリケーション例をご紹介します。
①50 kb超の超長鎖PCR増幅
超長鎖DNAの増幅性能は、ロングリードシーケンス用鋳型調製において重要なポイントです。PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseは、50 kbを超える超長鎖DNAを安定して増幅できます。
実験詳細はアプリケーションノートをご覧ください。
②GC/ATリッチターゲットの長鎖マルチプレックスPCR
GCリッチあるいはATリッチなターゲット領域において、
PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseは非特異的な増幅を抑えた長鎖マルチプレックス増幅が可能です。
③長鎖マルチプレックスPCRを用いたロングリードNGS解析
長鎖マルチプレックスPCRを用いてターゲット領域の全長をNGS解析するには、PCR酵素の選択が重要です。 複数のPCR酵素を評価した結果、PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseは最も良好な結果を示しました。
(評価内容)
- 20種のマルチプレックスPCR
- ロングリードNGS解析（On-Target率、デプスの均一性、ターゲット領域全長の増幅確認）
④長鎖増幅に最適な推奨プライマー設計の検証
～PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを用いる場合のプライマー設計～
PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseの性能を最大限に引き出すには、Tm値の十分に高いプライマーを設計することが重要です。 本製品の「プライマー推奨設計方法」を基にプライマーを設計し、最適な条件を検証しました。
実験の詳細はアプリケーションノート をご覧ください。
Biozにて、PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを用いた論文が続々と報告されています！
論文の詳細は製品情報ページ内の使用文献をご覧ください。
まとめ
適切なPCR酵素を選択することで、ロングリードシーケンス解析の成功率は高まります。PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseは、高い特異性により非特異的増幅を抑制し、長鎖でのマルチプレックスPCR反応を可能にするロングリードシーケンスに最適なPCR酵素です。
本酵素により、長鎖配列シーケンス時の均一なゲノム解析が可能になります。
また、ロングリード解析の精度を高めるには、酵素の選択とともにプライマー設計も重要なポイントです。
最適化されたワークフローで、より信頼性の高いデータ取得を実現しましょう。
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